PCR von pathogenen Keimen

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08.03.2012 - Chur

15.03.2012 - Basel

29.03.2012 - Wigoltingen/Hasli

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Buch:

Labor + Praxis

2. überarbeitete Auflage

Informationen zum

Impftiterkontrolle gegen Impfverdrossenheit

Nachweis von pathogenen Erregern mit PCR

Aus biologischen Proben wie Blut, Urin, Kot, Gewebe und Exsudaten können mittels PCR (polymerase chain reaction) spezifische Teile aus der DNS bzw. RNS von pathogenen Erregern gewonnen und bestimmt werden. Da diese Methode höchst empfindlich ist, werden weder vorausgegangene Anreicherungen in Kulturen noch grössere Mengen an Probematerial benötigt. In gewissen Momenten kann eine Verunreinigung mit den gleichen Erregern wie z.B. Staphylokokken ein Problem darstellen, wenn die Proben nicht lege artis entnommen wurden.

Probenmaterial

Eine PCR macht Sinn, wenn

eine Bakteriämie/Virämie vorliegt,
die Erreger das Zielorgan erreicht haben und klinische Symptome auslösen,
noch keine Therapie gegen die pathogenen Erreger begonnen wurde.

Bei Verdachstmomenten kann es sinnvoll sein, biologische Flüssigkeiten vor einem Therapiebeginn im Kühlschrank aufzubewahren, damit bei Bedarf PCR in einem späteren Zeitpunkt noch nachträglich durchgeführt werden können.

Blutproben

Nur EDTA- und Zitrat-Blut ist für PCR geeignet. Heparin kann die Reaktion stören. Blutproben nicht gefrieren. Sie können aber mehrere Tage im Kühlschrank aufbewahrt werden.

Andere biologische Flüssigkeiten

Urin, Punktate, Synovia, zerebrospinale Flüssigkeiten sind für eine PCR geeignet. Je nach Test werden 0.5 – 5 ml Flüssigkeit benötigt, die in sterilen Röhrchen ohne Zusätze aufbewahrt und versandt werden können. Auch diese Proben sollten nicht gefroren werden.

Kotproben

Kotproben (2 Gramm genügt) können in sterilen Röhrchen ohne Zusätze versandt werden.

Tupferproben für PCR

Proben müssen mit trockenen und sterilen Tupfern entnommen werden. Bitte KEIN Transportmedium verwenden. Für gleichzeitig durchzuführende bakteriologische Untersuchungen müssen separat Tupferproben MIT Transportmedium entnommen werden.

Biopsien und Organmaterial

Die Proben werden am besten in sterilen Röhrchen oder Szintillationsfläschchen (können bei uns angefordert werden) in isotoner Kochsalzlösung eingesandt.

Beurteilung der Resultate

Positives PCR-Resultat
Die gesuchte DNS/RNS konnte nachgewiesen werden.
Vorsicht

Kein Hinweis möglich, ob Erreger lebend und vermehrungsfähig ist
Kontamination in Betracht ziehen.

Negatives PCR-Resultat
Die Probe enthält die gesuchte DNS/RNS nicht oder ist in so kleiner Menge vorhanden, dass sie nicht amplifiziert werden kann.
Vorsicht:

Unzweckmässiges Probenmaterial
Probe enthält Heparin
Transport länger als 48 Stunden
Probe mehrmals gefroren (z.B. Babesia)

Pathogene Erreger

Erreger	Material	Menge	Kommentar
Anaplasma spp. (CGE)	EDTA-Blut	1 ml	4 Tage nach Infektion nachweisbar, vor Serokonversion
Babesia spp.	EDTA-Blut	0.5-1 ml	Erreger vor Serokonversion (erst ca. 2 Wochen nach Infektion) nachweisbar. Falsch negative PCR, wenn nur wenige Erreger in den Erythrozyten vorhanden sind.
Bartonella henselae	EDTA-Blut	0.5-1 ml	Katzen können über Monate und Jahre bakteriämisch bleiben; meist symptomlos. Bestimmung sinnvoll, wenn Katzenbesitzer immun-supprimiert sind.
Borrelia spp.			Mit PCR kann eine bestehende Infektion nachgewiesen werden. Nur ansteigende oder hohe Serum-Titer sind für eine laufende Infektion beweisend. Ausnahme: C6-Antikörper werden nur nach Infektion aber nicht nach Impfungen gebildet. Negative PCR schliesst eine Borreliose nicht aus, da der Erreger nicht überall nachgewiesen werden kann.
	Synovia	0.5 ml	Lahmheit
	EDTA-Blut	0.5-1 ml	Akute, fieberhafte Erkrankung, Probeentnahme vor Antibiotikum-Therapie
	Urin	5 ml	Akute, fieberhafte Erkrankung, Probeentnahme vor Antibiotikum-Therapie
	Zerebrospinal-Flüssigkeit	0.5ml
Calicivirus (felines)	Tupfer		Konjunktivale oder oropharyngeale Abstriche
Chlamydophila felis			Mit Tupfer möglichst viel lokales Gewebe aufnehmen, da Erreger intrazellulär ist.
	Tupferprobe		Konjunktivitis
	Tupferprobe		Probeentnahme von Nase und Pharynx bei Erkrankungen des Respirationsapparates
	Vaginaltupfer		Nach Aborten
Chlamydophila psittaci	Kloakentupfer, ev. Kot		Bei Vögeln oft symptomlos; Infektion kann Monate lang dauern. Klinisch erkrankte Tiere scheiden mehr Keime aus als latent infizierte. Ev. Mehrmals testen, da intermittierende Ausscheidung möglich
Coronavirus (canines)	Tupfer aus Rektum		Das canine Coronavirus kann nur in der ersten Woche der Infektion nachgewiesen werden
	EDTA-Blut	0,5 – 1 ml	Nur zu Beginn einer akuten, fiebrigen Gastroenteritis nachweisbar
Coronavirus (felines)	Kot, Rektaltupfer	2 Gramm Kot	Erfassung von Virusausscheider (interessant für Züchter)
	Punktat von Effusionen (z.B. Ascites)	0.5 ml	Positive PCR zusammen mit klinischer Erkrankung, therapieresistentem Fieber, Serologie und typischen klinisch-chemischen Befunden
Ehrlichia canis	EDTA-Blut	1 ml	4 Tage nach Infektion nachweisbar, vor Serokonversion
FeLV (Progenom)	EDTA-Blut	1 – 2 ml	Nur sinnvoll bei Verdacht auf FeLV und negativem Befund beim Nachweis auf FeLV-Antigen, ist auch abhängig vom "Provirus Load" der infizierten Zellen
FIV (Progenom)			Serokonversion erst nach 2 – 4 Wochen, nicht bei allen infizierten Tieren
	Lkn-Aspirat
	EDTA-Blut	1 – 2 ml	Oft nur positive PCR zu Beginn klinischer Symptome
Herpesvirus I (canines)	Gewebsproben von toten Welpen: Leber, Niere, Milz, Lunge	ca. 2 Gramm	Akute Todesfälle bei Welpen jünger als 3 Wochen alt
	Abortmaterial	ca. 2 Gramm
	Vaginaltupfer		Nach Abort
	Tupferproben von Nase, Maul und Pharynx
Herpesvirus (felines)			Chronisch infizierte Tiere scheiden Herpesviren intermittierend aus
Herpesvirus (felines) (Fortsetzung)	Augentupfer		Keratokonjunktivitis
	Tupfer		Probeentnahme von Nasensekret und Pharynx bei Rhinotracheitis
	Vaginaltupfer		Nach Abort
	Abortmaterial
Leishmania spp.	Konjunktiva-Tupfer		Sehr zuverlässig, positive PCR vor Seroconversion
	Lkn-Punktat		Lymphadenopathie
	Knochenmark-Punktat		Als Therapiekontrolle (Aufwand?!)
	Wundsekret		Chronisch infizierte Wunden, klinischer Verdacht auf Leishmaniose
Leptospira spp.	EDTA-Blut	0.5 – 1 ml	Erfolgreiche PCR in den ersten 2 Wochen nach Infektion; vor AB-Therapie, vor Serokonversion möglich
	Urine	5 ml	Später als 2 Wochen nach Infektion Nachweis im Urin zuverlässiger. Dauerausscheider auch nach Wochen und Monaten erfassbar. Ausscheidung inter-mittierend → ev. mehrmalige Bestimmung notwendig
Mycoplasma haemofelis / Candidatus Mycoplasma haemo-minutum	EDTA-Blut	0.5 ml	Früher Haemobartonella felis. PCR Mittel der Wahl zum Nachweis dieser Erreger
Parvovirus (canines und felines)	Rektaltupfer, Kot		Ausscheidungsdauer: 4 – 14 Tage nach erfolgter Infektion. Schnelltest sind aber meistens zuverlässig und eine PCR nicht notwendig
Staupe			Die Virusreplikation erfolgt ca. 1 Woche nach Infektion
	EDTA-Blut	0.5 – 1 ml	Nur wenn fieberhafte, klinische Erkrankung
	Konjunktival-Tupfer		Klinische Erkrankung mit ausgeprägter Konjunktivitis
	Zerebrospinal-Flüssigkeit	0.5 ml	ZNS-Symptome
	Rektaltupfer		Klinische Symptome inkl. Gastroenteritis
Toxoplasma gondii			Nur hohe oder ansteigende Antikörpertiter erlauben die Diagnose einer laufenden Toxoplasmeninfektion. Der Nachweis mittels PCR aus Kot ist schwierig, da mittels Labormassnahmen die Oozysten kaum aufge-schlossen und die DNS nicht freigelegt werden kann.
	EDTA-Blut	0.5 ml	Bei fieberhaften, klinischen Erkrankungen
	Zerebrospinal-Flüssigkeit	0.5 ml	Bei zentralnervösen Störungen
	Abortmaterial		Plazenta, ZNS von abortierten Foeten, Vaginaltupfer
	Bronchial-Lavage	5 ml	Erkrankung des Respirationsapparates

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